NGS: فناوری های نوین ژنتیک در تشخیص و درمان

مقدمه‌ای بر فناوری NGS

NGS “Next Generation Sequencing” یا توالی یابی نسل جدید مجموعه ای از دستگاه ها و نرم افزارهای لازم برای خوانش آنچه که در توالی DNA ما می گذرد فراهم آورده است تا به وسیله آن متخصصان بتوانند حتی بیماری ها با علت ناشناخته را تشخیص دهند و یا در انتخاب بهترین درمان برای سرطان ها اقدام کنند.

 علم ژنتیک امروزه بیشترین مقالات را در زمینه های پژوهشی به خود اختصاص داده است و بنابراین طبیعی است که شاهد پیشرفت این علم با سرعت باورنکردنی باشیم. در ادامه قصد داریم در ابتدا از الفبای این علم که شامل ساختمان ژنتیک، تغییر و ارتباط آن با بیماری ها است به تازه ترین پیشرفت ها در این حوزه و نحوه تشخیص این تغییرات از طریق به روز ترین روش ها همچون روش های NGS و کاربردهای آن در زندگی بشر بپردازیم.

قد بلند و قدکوتاه سفید پوست یا سیاه، چشم آبی یا قهوه ای مو بلوند یا مشکی باهوش و خلاق یا بی استعداد و تنبل..!!!!

تمام این ویژگی ها در ژنتیک شما نهفته است. دریافتن این مطلب که چگونه ژن های ما پدید آورنده تمام این ویژگی ها از جمله ویژگی های ظاهری و یا اخلاقی و یا حتی سالم و یا بیمار شدن ما هستند خود به دانشی بسیار جذاب به اسم علم ژنتیک تبدیل شده است که امروزه پژوهشگران و دانشجویان بسیاری را با خود همراه کرده است.

کوچکترین ساختمان سازنده موجودات زنده یعنی سلول شامل توالی های DNA که به صورت فشرده تنها بخشی از حجم یک سلول را به خود اختصاص می دهند تشکیل شده است. این توالی های DNA تمامیت حیات را در خود جای داده اند و کنترل بسیاری از رخدادها از جمله بیمار شدن و یا نشدن یک فرد در طول زندگی، میزان پیشرفت یک بیماری در فرد ،تاثیر متفاوت یک دارو در افراد مختلف که به پزشکی شخصی (Personalized medicine) شناخته می شود همه و همه را در دست دارند.

 به طور کلی می توان گفت که موجودات زنده از سلول هایی تشکیل شده اند که هر سلول یوکاریوتی حامل یک هسته است که ساختار ژنتیکی ما را در خود جای داده است. DNA تمام اطلاعاتی را که برای تولید انسان ضروری است، مانند یک کتابچه راهنمای دستورالعمل، ذخیره می کند. با تبدیل مولکول های DNA به RNA طی فرآیند رونویسی اطلاعات ذخیره شده در DNA قابل استفاده می شوند. به بخش هایی از DNA که به RNA رونویسی شده، مناطق کد کننده یا ژن می گویند.

 بنابراین، RNA ها اطلاعات DNA را به خارج از هسته منتقل می کنند. این مولکول های پیام رسان در ادامه برای ساخت پروتئین طی فرآیند ترجمه در دسترس اندامک ریبوزوم قرار می گیرند. پروتئین ها از اسیدهای آمینه تشکیل شده اند و تقریباً تمام عملکردهای ساختاری، تنظیمی و انتقال سیگنال را در بدن به عهده دارند.

 بنابراین، RNA ها و در نتیجه پروتئین‌ ها، واسطه‌ های ضروری آنچه در DNA راهنمای دستورالعمل ما نوشته شده است هستند. این که کدام بخش از DNA به RNA رونویسی می شود و در نهایت به پروتئین ترجمه می شود، بسته به نوع تمایز هر سلول، بین انواع مختلف سلول ها متفاوت می باشد. بنابراین، برای مثال، یک سلول مغزی (نورون) الگوی بیان ژن متفاوتی را نسبت به سلول کبدی (هپاتوسیت) نشان می‌دهد.

DNA مخفف دئوکسی ریبونوکلئیک اسید، یک ماکرومولکول متشکل از واحدهای نوکلئوتید می باشد. ستون فقرات DNA از مولکول های متناوب تشکیل شده است: دئوکسی ریبوز و فسفات که با نوکلئوبازهای مهم A (آدنین)، C (سیتوزین)، G (گوانین) و T (تیمین) که به دئوکسی ریبوز متصل شده اند، تکمیل می شود.

مولکول DNA دو رشته ای، موازی و نا هم سو جهت گیری شده و به صورت مارپیچ سه بعدی سازماندهی شده است. حال تغییر در هر یک از این نوکلئوتیدها از جمله جابه جا شدن آن ها با یک نوکلئوتید دیگر یا حذف شدن و یا اضافه شدن تعدادی از آن ها به توالی DNA جهش نامیده می شود که در برخی از موارد تاثیرات مخربی از جمله ایجاد بیماری در فرد را به همراه دارد.

بنابراین برای تشخیص این تغییرات برروی توالی DNA از روشی به نام توالی یابی Sequencing بهره می برند که در طی آن تک تک نوکلئوتیدهای تشکیل دهنده یک ژن خوانش شده و در حقیقت رمز ژنتیکی هر فرد قابل شناسایی است. در این فرآیند، سطوح مختلف داده‌ها، از مشاهدات بالینی منفرد تا مجموعه داده‌های مولکولی پیچیده، مورد بررسی قرار می‌گیرند تا رویکردی که به عنوان "پزشکی سیستمی" “systems medicine” شناخته می شود را درتوسعه روش های درمانی یاری رساند.

توالی یابی اسید های نوکلئیک با تکنولوژی نسل اول و دوم

در روش های توالی یابی نسل اول همچون روش سنگر که اولین بار در سال 1977 میلادی معرفی شد امکان رمزگشایی توالی های کوچکی از DNA در هر بار خوانش فراهم شد. در سال های آتی این روش با کمی پیشرفت اساس توالی یابی ژنوم (کل محتوای ژنتیکی یک فرد) قرار گرفت که به وسیله آن ژنوم انسان با سه میلیارد نوکلئوتید را طی سیزده سال به صورت موازی در چندین مرکز جهان با هزینه ای بالغ بر سه میلیارد دلار توالی یابی کردند.

 به دست آوردن چیدمان آرایش بازی ژن های انسان برای اولین بار در جهان  پیشرفتی عظیم در علم ژنتیک را رقم زد که به موجب آن این اندیشه که با آن بتوان تک تک افراد را منحصرا توالی یابی و شناسنامه ژنتیکی فردی برای هر شخص در نظر گرفت را در ذهن دانشمندان شکوفا نمود. اما برای دستیابی به این هدف نیاز به روشی است که در مدت زمان کمتر با هزینه ای بسیار پایین تر ژنوم هر فرد را توالی یابی کند.

 این روش ها که به نسل های دو و سه توالی یابی معروف هستند و به اصطلاح توالی یابی نسل بعد Next Generation Sequencing (NGS) نامیده می شوند قادرند در مدت زمان بسیار کمی بین دو هفته تا حتی دو ساعت با هزینه ای حدود 1000 دلار توالی ژنتیکی هر فرد را رمز گشایی کنند.

 از زمان تکمیل پروژه ژنوم انسان در سال 2003، پیشرفت شگفت انگیزی در فناوری های توالی یابی صورت گرفته است.با اینکه تعداد و تنوع ژنوم های توالی یافته به طور چشمگیری افزایش یافت با این حال هزینه توالی یابی هر مگاباز کاهش داشته است. در طول 5 سال گذشته، توالی یابی نسل بعدی (NGS) از تحقیقات به سمت استفاده در مقاصد بالینی منتقل شده است. حداقل 14 کشور توالی یابی را برای جمعیت های بزرگ آغاز کرده اند و پیش بینی می شود که تا سال 2025 بیش از 60 میلیون نفر در سراسر جهان توالی ژنوم خود را تعیین کنند.

کاربرد‌های فناوری NGS

از جمله مهمترین کاربردهای NGS می توان به توالی یابی مولکول های DNA و RNA اشاره کرد که علاوه بر شناسایی توالی های جدید در این مولکول ها کمک به تشخیص جهش ها ،شناسایی برهم کنش بین توالی های DNA و پروتئین ،میزان بیان ژن ها و حتی تغییرات اپی ژنتیکی خواهد کرد. از این رو، داده های خروجی NGS بینش خوبی در مورد ویژگی های ساختاری و عملکردی سلول ها و بافت ها در اختیار ما قرار می دهد.

 کاربردهای معمول روش‌های NGS در میکروبیولوژی و ویروس‌شناسی، علاوه بر توالی‌یابی کل ژنوم با کارایی بالا، کشف میکروارگانیسم‌ها و ویروس‌های جدید با استفاده از رویکردهای متاژنومی، بررسی جوامع میکروبی در محیط و در جایگاه‌های بدن انسان در شرایط سالم و بیماری است. NGS در میکروبیولوژی مواد غذایی نیز با تعیین توالی کل ژنوم یک کلنی از باکتری، یک ویروس و یا هر ارگانیسم دیگری که معمولاً به عنوان "متاژنومیکس" شناخته می شود کاربرد دارد.

 NGS همچنین درآزمایشگاه های پزشکی قانونی به آزمایشگران این اجازه را می‌دهد تا داده‌هایی که کل ژنوم انسان را در بر می‌گیرد دستیابی پیدا کرده و به طیف وسیع‌تری از سؤالات پاسخ دهند. علاوه بر این،  تکرار پشت سر هم کوتاه (STR) توالی یابی شده توسط NGS کاملاً با فرمت‌های پایگاه داده فعلی سازگار هستند. توالی یابی نسل بعدی (NGS) کاهش قابل توجه هزینه های پروفایل و تجزیه و تحلیل ژنومی، دسترسی به راه های متعددی را در بخش دارویی و تشخیصی، به ویژه در حوزه پزشکی شخصی، فراهم کرده است.

از روش های NGS همچنین برای تشخیص پیش از تولد نیز استفاده می کنند. در این روش در چند ماهه اول بارداری خون مادر را گرفته و DNA های جنینی آزاد شده در آن cell-free fetal DNA (cffDNA)) را جدا و با روش های NGS توالی یابی می کنند. به کمک این روش ناهنجاری احتمالی جنین را پیش تولد می توان تشخیص و اقدام مناسب را انجام داد. از جمله مزایای این روش می توان به غیر تهاجمی بودن آن بدون آسیب رسیدن به جنین ،سرعت و توان بالای عملیاتی اشاره کرد.

از جمله روش های توالی یابی انجام شده با NGS یکی توالی یابی کل ژنوم (WGS) بوده که از جمله پرکاربردترین شکل NGS است و به تجزیه و تحلیل کل توالی نوکلئوتیدی یک ژنوم می پردازد. از طرف دیگر توالی یابی کل اگزوم (WES) شکلی دیگر از توالی یابی هدفمند است که فقط به توالی یابی اگزون های کد کننده پروتئین می پردازد.

مراحل اساسی در NGS کدامند؟

توالی یابی نسل بعدی شامل سه مرحله اساسی است: آماده سازی کتابخانه، توالی یابی و تجزیه و تحلیل داده ها.

براساس روش به کار گرفته شده برای توالی یابی می بایست در ابتدا قطعات برای خوانش آماده شوند. مراحل آماده سازی شامل قطعه قطعه کردن توالی های DNA و اضافه کردن توالی های معلوم به نام آداپتور به هر دو انتهای قطعات می باشد. این قطعات با روش های گوناگون بر پایه PCR تکثیر شده و یک کتابخانه را تشکیل می دهند. در ادامه هر کتابخانه توالی یابی شده و در نهایت حجم عظیمی از داده های توالی یابی شده در یک فایل جهت انجام آنالیزها به دست درخواست کننده می رسد.

 فناوری توالی یابی نسل بعدی یا NGS یک فناوری توالی یابی موازی انبوه است که به عنوان یک روش High throughput با سرعت فوق العاده بالا عمل می کند. فناوری NGS برای تعیین توالی نوکلئوتیدهای ژنوم در سطح DNA و یا RNA کاربرد دارد. دستگاه های متعددی برای انجام این عمل طراحی شده اند که هر یک مسیر های مختلفی را برای رسیدن به توالی کل ژنوم به کار گرفته اند. جدای از این گوناگونی و تحول روز به روز این روش ها و دستگاه ها بخش چالش برانگیز نهایی آنالیز خروجی حاصل از آن ها می باشد.

 طبیعی است که آنالیز خروجی روشی همچون سنگر یک فایل ساده با تنها یک توالی است در حالی که در روش های NGS خروجی نهایی شامل میلیون ها قطعه از جای جای ژنوم می باشد. در نتیجه با اینکه روش های NGS با ابداع دستگاه های بسیار کارآمد زمان و هزینه توالی یابی بسیار کاهش داده اند ولی برای حصول یک نتیجه نهایی قابل قبول و راضی کننده بخش نهایی کار یعنی آنالیز انبوه داده های NGS از اهمیت بسیار بالایی برخوردار است.

 دستگاه های توالی یاب در این زمینه به ندرت در ایران یافت می شوند و محققان اغلب توالی های خود را برای سکانس به دیگر کشورها فرستاده و تنها نتایج نهایی توسط خود آن ها آنالیز می شود. در این زمینه نیز محققان علم بین رشته ای بیوانفورماتیک با بهره گیری از علوم مهندسی کامپیوتر نرم افزارهای بسیار کاربردی و راه گشا در این زمینه را خلق کرده اند که امکان مدیریت داده های عظیم و یا به اصطلاح Big data را برای محققان حوزه بیولوژی فراهم آورده است.

  از جمله سرفصل های آنالیز داده های NGS شامل:

• ارزیابی کیفی فایل FASTQ و Trimming آن
• هم ردیف سازی (Alignment) سکانس ها با ژنوم مرجع
• فراخوانی واریانت ها (Variant Calling)
• برگزینی واریانت عامل بیماری زایی به کمک گایدلاین های فیلتراسیون

امروزه یادگیری آنالیز داده های NGS به مراتب با ارزش تر است چرا که به تصمیم گیری انسانی وابسته بوده و به کمک ماشین ها به طور اتومات قابل انجام نمی باشد. نیازجامعه به آنالیزورهای با تجربه در حیطه NGS  روز به روز در حال افزایش است که بازار کار بسیار خوبی را نیز برای این عده به همراه دارد.

در این حوزه آزمایشگاه ژنیران به عنوان  یکی از معدود مراکز موجود در کشور آموزش حضوری آنالیز داده های NGS را برای علاقه مندان به این علم نوین فراهم آورده است که دانشجویان پس از گذراندن این دوره بر اساس قابلیت های فردی خود می توانند در همین مرکز به عنوان آنالیزور استخدام شوند.

انجام خدمات توالی یابی اسید های نوکلئیک

همچنین در این حوزه آزمایشگاه ژنیران از مرحله استخراج نمونه های RNA و DNA، ارسال نمونه ها برای توالی یابی تا آنالیز داده های NGS از مرحله FASTQ و در نهایت گزارش نویسی بالینی خدمت رسانی می نماید.